Метод рекомбинантных плазмид соматическая гибридизация. Реферат: Рекомбинантные белки

9384 0

Исследование молекул ДНК

За последние годы методы исследования ДНК получили колоссальное развитие. К самым совершенным методам, с помощью которых изучается ДНК, относятся методы создания молекул ДНК путем соединения последовательностей, имеющих совершенно различное происхождение. Получаемый продукт называют рекомбинантной ДНК.

Рекомбинантная ДНК содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Основные исследования выполнены на бактериях и вирусах, так как они являются одними из самых простых организмов, иначе их называют клетками «хозяина». Технология рекомбинантной ДНК позволяет получать генетические видоизмененные варианты целенаправленным и строго контролируемым путем.

Каким же образом гены высших организмов могут быть введены в бактериальные клетки? Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных ДНК, т. е. содержащих чужеродный ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких тысяч пар нуклеотидов. Каждая бактерия, помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5106 пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.

Плазмиды являются автономными генетическими, реплицирующими (т. е. размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные гены для бактерий, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат различные гены устойчивости к антибактериальным препаратам. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они «входят» и «выходят» из бактерий, используется генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.

Мощным инструментом генной инженерии являются открытые в 1974 г. ферменты - рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы.

Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактерии клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной (в первую очередь фаговой ДНК), что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы «узнают» определенные последовательности нуклеотидов в ДНК (так называемые сайты - участки узнавания) и вносят симметричные разрывы в цепях ДНК на равных растояниях от центра сайта. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированных ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты», которые называются «липкими концами».

Из разных видов бактерий выделено около пятисот различных рестриктаз, для которых описаны сайты рестрикции.

Методы генной инженерии

Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одна из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Гены, которые нужно ввести в бактериальную клетку, выщепляют из ДНК хромосом человека с помощью той же рестриктазы, поэтому его «липкие концы» являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды. Ферментом лигазой «сшивают» оба конца ДНК (гена и плазмиды), в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии называются клоном и содержат в плазмидах чужеродный ген, способный вырабатывать белок, кодируемый этим геном.

Весь процесс получения таких бактерий, называют клонированием. Он состоит из последовательных стадий (рис. 3.3):
1. Рестрикции - разрезания ДНК человека рестриктазой на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.

Рис. 3.3. Введение гена в плазмиду Escherichia coli и клонирование этого гена в клетках кишечной палочки
Плазмида E.coli расщепляется рестрикционной эндонуклеазой в специфическом участке в обеих цепях ДНК, так что на концах расщепленной плазмиды располагаются короткие неспаренные последовательности дезоксирибонуклеотидов (ТТАА или ААТТ), т. е. по четыре нуклеотида, в которых основания представлены тимином и аденином.
Ген, который нужно встроить в плазмиду, выщепляют с помощью этой же рестриктазы, так что его концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды (ААТТ и ТТАА).
Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают вместе с помощью лигазы. Затем рекомбинантную плазмиду вводят в клетку Е.соН,которая, размножаясь, образует клон, все клетки которог содержат рекомбинантную плазмиду, а поэтому и чужеродный ген. Последний теперь клонирован в клетках кишечной палочки и индуцирует в ней синтез специфическогобелка.

2. Лигирования - включения фрагмента ДНК человека в плазмиды благодаря сшиванию «липких концов» ферментом лигазой.

3. Трансформации - введения рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плаз-миды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Их разделяют, используя определенную питательную среду (например, раствор антибиотика). Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.

4. Скрининга - отбора среди клонов трансформированных бактерий тех, которые сохраняют плазмиды, несущие ген человека.

Не всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей или не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктазами. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают не с вырезания из хромосом случайных фрагментов ДНК, а с целенаправленного получения нужного гена.

Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, которая является транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента - обратной транскриптазы (ревертазы) - синтезируют комплементарную цепь ДНК, после чего и-РНК, служащая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается РНК-азой - специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой (ДНК-полимераза) комплементарной второй цепи ДНК.

Получаемая двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК), она соответствует гену, с которого была считана и-РНК. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которая трансформирует бактерии, и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Установите соответствие между методами и областями науки и производства, в которых эти методы используются: к каждой позиции, данной в первом столбце, подберите соответствующую позицию из второго столбца.

Запишите в таблицу выбранные цифры под соответствующими буквами.

A	Б	В	Г	Д	Е

Пояснение.

Биотехнология - это производство необходимых человеку продуктов и материалов с помощью живых организмов, культивируемых клеток и биологических процессов.

Селекция: получение полиплоидов; испытание по потомству; гетерозис. Биотехнология: метод культуры клеток и тканей; использование дрожжей для производства белков и витаминов; метод рекомбинантных плазмид.

Ответ: 122211.

Примечание .

Плазмиды – мелкие кольцевые молекулы ДНК, присутствующие в клетках бактерий. Они содержат дополнительную генетическую информацию, способны автономно, независимо от ДНК хромосом, реплицироваться; некоторые плазмиды обладают способностью встраиваться в хромосому бактерии и выходить из нее; некоторые могут переходить из одной клетки в другую. В генетической инженерии наиболее широко используется три типа плазмид F, P и Col. Метод создания рекомбинантных плазмид был разработан П.Бергом в 1972г. Ими была создана рекомбинантная плазмида, содержащая галактозный оперон E.coli. В плазмиду могут быть включены природные или синтезированные гены. После проникновения в клетку бактерии рекомбинантная плазмида может функционировать и размножаться автономно, либо включаться в ДНК хромосомы бактерии. Таким методом в клетки бактерии были введены гены человека и созданы штаммы бактерий-суперпродуценто соматостатина, интерферона, инсулина, гормоны роста человека, быка, глобин животных и человека.

Разработка биотехнологии производства интерферона – сложный процесс, требующий строгой регламентации действий на многочисленных этапах. Рассмотрим получение интерферона с помощью технологии рекомбинантной ДНК . Рекомбинантную молекулу ДНК получают встраиванием определенных генов в ДНК. С помощью ферменто-рестриктаз «разрезают» участки исходной ДНК и выделяют нужные гены. Другой фермент – лигаза – «вшивает» гены в новую ДНК. Микроорганизмы с рекомбинантной ДНК при их выращивании производят нужный продукт.

Вначале выделенную из крови доноров и находящуюся в культуре суспензию лейкоцитарных клеток обрабатывают вирусом, оказывающим индуцирующий эффект на биосинтез интерферона. В дальнейшем из лейкоцитов получают иРНК, программирующую биосинтез интерферона. Даже в индуцированных вирусом Сендай лейкоцитах иРНК содержится не более 0,1 % (Смородинцев А.А., 1985).

С помощью фермента обратной трансриптазы (ревертазы) на полинуклеотидной основе иРНК синтезируют комплементарную ей одноцепочечную копию ДНК (кДНК). Этому этапу предшествует синтез дезоксирибонуклеотида – затравки, состоящей из 32 мононуклеотидов, которая при гибридизации взаимодействует с соответствующим комплементарным участком выделенной из лейкоцитов иРНК и в дальнейшем выступает в качестве стартовой отметки, от которой начинается РНК-зависимый синтез одной из цепей ДНК (кДНК).

На следующем этапе на отделенной от гибридной структуры ДНК –РНК одноцепочечной кДНК осуществляется биосинтез второй комплементарной цепи ДНК. Чтобы обеспечить в синтезированной к ДНК комплементарность липких концов, к ним присоединяются линкеры (переходники). Они являются синтезированными химическим путем короткими участками ДНК, имеющими разные липкие концы. Обработка рестрикционной эндонуклеазой концов кДНК, а также подобранной плазмиды вектора. Которая в результате ферментативного гидролиза расщепляется рестриктазой с образованием линейной молекулы ДНК с липкими концами, позволяет соединить кДНК с плазмидой и благодаря липким концам и с помощью ДНК-лигазы образовать кольцевидную рекомбинантную плазмиду с синтезированной кДНК, в которой находится ген, кодирующий биосинтез а-интерферона.

Затем рекомбинантную плазмиду необходимо ввести в бактериальную клетку. Следующий этап – поиск бактериальной клетки, содержащей ген интерферона. По такому признаку, как способность к гибридизации, идентифицируют бактерии, содержащие рекомбинантные плазмиды с включенным в них геном, кодирующим синтез интерферона. Эти рекомбинантные плазмиды из бактерий выделяют и с помощью рестриктаз получают гены интерферона. Эукариотический интерфероновый ген в бактериальной клетке кодирует синтез «сырого» интерферона, для превращения которого зрелый интерферон в эукариотических клетках нет необходимых условий. Для преодоления этого препятствия эукариотический ген в условиях in vitro перестраивают, удаляя соответствующей рестриктазой ту часть нуклеотидов, которые кодируют информацию, не входящую в молекулу функционального интерферона. При этом в ходе рестриктазной реакции получается «перебор». Одновременно удаляется триплет, кодирующий синтез первой аминокислоты в полипептидной цепи интерферона. Этот, а также предшествующий ему инициирующий биосинтез полипептидной цепи кодоны синтезируют химическим путем и присоединяют к гену интерферона. Созданный в результате сложных манимуляций ген переносится в плазмиду, где он совмещается с бактериальным промотором, а затем вводится в бактериальную клетку-хозяин. Таким сложным многоэтапным путем создан штамм-продуцент E.coli. В 1 л бактериальной суспензии, содержащей около 1011 клеток, концентрация а-интерферона достигает 5 мг, что в 5 тыс. раз больше того количества, которое можно получить из 1 л донорской крови.

Лекция№5 Генетическая инженерия.

Генная инженерия . Высшим достижением современной биотехнологии является генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.

По своим целям и возможностям в перспективе это направление является стратегическим. Оно позволяет решать коренные задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции при оздоровлении экологической обстановки во всех видах производств.

Важнейшим этапом для развития биотехнологии было выделение в середине текущего столетия молекулярной биологии в самостоятельную дисциплину. Возникновение молекулярной биологии стало возможным благодаря взаимодействию генетики, физики, химии, биологии, математики и др. Э. Чаргофф и З. Д. Хочкис, исследуя молекулярные соотношения нуклеотидных оснований в ДНК (аденин, гуанин, цитозин, тимин) показали, что у различных организмов они одинаковы. Это открытие сыграло ключевую роль в установлении структуры ДНК.

Большую роль в расшифровке структуры ДНК сыграл прогресс в области генетики бактерий и бактериофагов. Было установлено (А. Херши, М. Чейз, Дж. Ледерберг, Н. Циндер), что трансдукция (перенос генетического материала) может осуществляться с помощью бактериофага, а фаговой ДНК может принадлежать роль носителя наследственности. Б. Хейсом были выяснены также закономерности полового процесса у бактерий (конъюгация) , при котором из донорских клеток, имеющих F-фактор (фертильность), генетический материал переносится в реципиентные клетки. Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили комплиментарную модель строения ДНК и механизм ее репликации; было раскрыто уникальное свойство ДНК – способность самовоспроизведения (репликация).

На базе молекулярной биологии и генетики микроорганизмов к началу 60-х гг. сформировалась молекулярная генетика. Г. Гамов в 1954 году выдвинул гипотезу о том, что каждый кодон (последовательность нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту) должен состоять из трех нуклеотидов. В 1961 году было подтверждено экспериментально, что первичная структура белка закодирована в ДНК в виде последовательности нуклеотидных триплетов (кодонов), каждая из которых соответствует одной из 20 аминокислот. К 1966 году удалось получить данные о строении генетического кода.

Было установлено, что последовательность триплетных кодонов, хранящаяся в ДНК, переписывается в недолговечные молекулы информационной РНК (иРНК). Данный этап ДНК  иРНК был назван транскрипцией , а этап иРНК  белок – трансляцией . Перенос аминокислоты и определение ее местонахождения в синтезирующейся белковой молекуле осуществляет транспортная РНК (тРНК) . На ДНК, как на матрице, синтезируется РНК, а на РНК – белок. У некоторых вирусов отсутствует первое звено, и РНК служит для них материалом наследственности.

Механизм контроля генной активности долгое время оставался неизвестным. Большое значение имели работы Ф. Жакоба и Ж. Моно, показавшие, что у бактерий есть

структурные гены , дающие информацию о синтезе определенных белков

регуляторные гены, которые осуществляют включение или выключение отдельных генов или их блоков.

Следующим важным шагом было проведение работ по расшифровке нуклеотидных последовательностей (секвенирование) , которое дает информацию о первичной структуре участка генома, выполняющего определенные функции. Структура и функции приобрели общее молекулярно-биологическое выражение, его суть заключается в том, что функциональные состояния выражают структурные изменения макромолекул и ассоциаций.

От изучения закономерностей функционирования генетического материала в клетке вскоре исследователи перешли к генетическим манипуляциям. Возникла новая экспериментальная технология, заключающаяся во введении в клетки чужеродных генов. Названия «генетическая (или генная) инженерия» или «работа с рекомбинантными ДНК» эквивалентны. Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in vitro с последующим введением новых («рекомбинантных») генетических структур в живую клетку.

В 1972 году Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную молекулу ДНК, состоящую из фрагмента ДНК вируса ОВ40 и бактериофага  dvgal с галактозным опероном E. coli . Инструментом для генетического конструирования стали две группы ферментов – рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы) и лигазы . Первые необходимы для получения однородных фрагментов ДНК, вторые – для их соединения. Рестриктазы и лигазы в совокупности с другими ферментами (нуклеазами, обратной транскриптазой, ДНК-полимеразой и др.) обеспечивают проведение всех генноинженерных манипуляций.

Генная инженерия - совокупность методов, позволяющих в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов даёт возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим.

ЦЕЛЬ получение клеток, в промышленных масштабах нарабатывать некоторые белки.

1.Плазмиды.

Наиболее распространённым методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных (содержащих чужеродный ген) плазмид, которые представляют собой кольцевые, двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар нуклеотидов. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5*10 6 пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.

Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Плазмиды несут важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.

Большая часть таких препаратов (антибиотиков) используется в качестве лекарств при лечении заболеваний человека и домашних животных. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к антибиотикам, солям тяжёлых металлов. При действии определённого антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь.

Мощным элементом генной инженерии являются открытые в 1974 ферменты – рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы (ограничение). Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной (фаговой) ДНК, что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определённые последовательности нуклеотидов (сайты – участки узнавания) и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра сайта. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты», которые называют липкими концами.

Методы генной инженерии.

Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, расщепляют из ДНК хромосом человека с помощью рестриктазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмид. Ферментом лигазой «склеивают» оба куска ДНК в результате получается рукомбинантная кольцевоя плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген.

Что такое генетическая инженерия? Генетическая инженерия - это раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых комбинаций генетического материала. Основа прикладной генетической инженерии - теория гена. Созданный генетический материал способен размножаться в клетке-хозяине и синтезировать конечные продукты обмена.

Генная инженерия - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств.

В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот.

К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК;

успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты.

изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.

Реферат по биотехнологии

"Рекомбинантные белки (свойства плазмид, получение)"

Генетическая инженерия конкретнее и точнее клеточной по характеристике используемых объектов и оперирует в основном с разными по форме и размерам фрагментами клетки. Термиы «генетическая инженерия», «генная инженерия» и «рекомбинантная ДНК» - равноценны .

Генетическую инженерию можно представить как соединение фрагментов ДНК природного и синтетического происхождения или их комбинацию in vitro с последующим введением полученных рекомбинантных структур в живую клетку для того, чтобы введенный фрагмент ДНК после включения его в хромосому либо реплицировался, либо автономно экспрессировался.

Успехи генетической инженерии привели к тому, что свыше 100 белков человека (биорегуляторов, корректоров гомеостаза, факторов врожденного и приобретенного иммунитета) могут сохранять свою видеоспецифичность. Они нарабатываются как лекарственные средства путем микробтологического синтеза. При этом технология рекомбинантной ДНК позволяет их совершенствовать: повышать физиологическую активность, снижать вероятность побочных реакций после введения и так далее.

Основным при получении рекомбинантных белков является решение проблемы дефицита сырья, так как из человеческих тканей в промышленном масштабе получать их невозможно.

В качестве продуцентов рекомбинантных белков человека чаще других в настоящее время используются: E.coli (кишечная палочка), Bacillussubtilis (сенная палочка), Saccharomycescerevisiae (пекарские дрожжи).

Эти организмы достаточно безопасны, однако попадание их в окружающую среду по ряду причин нежелательно. В связи с этим существует принятые и тщательно соблюдаемые правила работы с рекомбинантами.

Безопасность должна соблюдаться на генетическом и на физическом уровне и это относится к производству любых рекомбинантных белков.

1. Методы генной инженерии при получении рекомбинантных белков

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А.А.). По Э.С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний .

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

Специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

Быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

Конструирование рекомбинантной ДНК;

Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

Клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов – прежде всего ферментов рестрикции. В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы .

Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. Однако одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК.

Одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая – содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК.

Для плазмид характерно стабильное существование в нехромосомном состоянии в бактериях. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5*106 пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.

Плазмиды, размеры которых варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч пар оснований, а число копий на клетку - от одной до нескольких сотен, способны к автономной (независимой от основной хромосомы) репликации и стабильно наследуются в ряду клеточных поколений.

Хотя многие плазмиды дают клеткам-хозяевам ощутимые селективные преимущества (устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.п.), большинство из них являются криптическими, то есть не проявляющимися в фенотипе клеток.

Область начала репликации небольшой плазмиды ColE1, несущей гены устойчивости к колицинам, традиционно используется в генной инженерии при конструировании векторных молекул ДНК, которые находят применение для клонирования и экспрессии в клетках E. coli коротких последовательностей нуклеотидов.

Плазмиды обнаружены у многих бактерий, принадлежащих к разным таксономическим группам. Количество плазмидной ДНК в клетке составляет обычно не более нескольких процентов от клеточного генома, а число плазмид колеблется от 1 до 38. Плазмиды - это линейные или кольцевые ковалентно замкнутые молекулы ДНК, содержащие от 1500 до 40000 пар нуклеотидов. Большинство плазмид состоит из трех групп генов: участка ДНК, ответственного за автономную репликацию плазмиды в клетке; системы генов, обеспечивающих возможность переноса плазмид из одной клетки в другую; генов, определяющих свойства, полезные для клетки-хозяина. Отличительная особенность плазмид - способность к автономной репликации, поэтому минимальное количество ДНК, которое может быть названо плазмидой, - это фрагмент, обеспечивающий автономную репликацию плазмидной ДНК в клетке как единого целого.

Обычно о присутствии плазмид в бактериальной клетке судят по проявлению определенных признаков, к которым относится устойчивость к отдельным лекарственным препаратам, способность к переносу генов при конъюгации, синтез веществ антибиотической природы, способность использовать некоторые сахара или обеспечивать деградацию ряда веществ.

Большинство бактериальных плазмид обладает способностью автономно реплицироваться, имеет фактор несовместимости и фактор переноса. Плазмиды несут множество специальных, детерминируемых каждой отдельной плазмидой маркеров: устойчивость к антибиотикам, тяжелым еталлам, ультрафиолетовому облучению, способность к биосинтезу токсинов.

В качестве векторов могут использоваться опухолеобразующие плазмиды бактерий. Виды Agrobacterium эволюционно родственны клубеньковым бактериям, относящимся к роду Rhizobium, и имеют много общих с ними черт. Однако характер взаимодействия агробактерий с растением имеет своеобразные особенности .

3. Получение плазмид

Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, то естьсодержащих чужеродный ген, плазмид.

Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5-6 млн. пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.

Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися (то есть размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.

Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инженерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественнного вектора» свойств:

Небольшого размера, так как эффективность переноса экзогенной ДНК в E.coli снижается при длине плазмиды более 15 тысяч пар нуклеотидов;

Наличие сайта рестрикции, в который осуществлена вставка;

Наличия одного или более селективных генетических мркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Ферментом лигазой «склеивают» оба куска ДНК в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген. Весь этот процесс называют клонированием.

Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42°С в течение 1,5 минут. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации -10 -3 , то есть на каждую тысячу клеток приходится одна трансформированная. Частота трансформации не бывает 100%-й, затем используют схемы отбора, позволяющие идентифицировать трансформированные клетки .

В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (донорного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличить трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки.

Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы в ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям:

1) наличию нескольких сайтов для клонирования;

2) возможности достаточно простой идентификации клеток с рекомбинантными ДНК.

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используется E.coliв качестве клетки-хозяина. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетентность E.coli повышают, используя специальные условия культивирования. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов E.coli была сконструирована плазмида, содержащая сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов – полиленкер.

Эффективными методами трансформации E.coli плазмидами является электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим током для увеличения их проницаемости). Для введения клонированных генов в соматические клетки также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).

Без преувеличения можно сказать, что прошлое, настоящее и будущее биотехнологии базируется на генетическом межвидовом и внутривидовом разнообразии организмов. Изменение уровня развития науки лишь способствует расширению и возникновению качественно новых способов использования этого разнообразия.

Так, интенсивное развитие фундаментальных исследований в биологии во второй половине ХХ столетия привело к существенному прогрессу в таких разделах биологии, как молекулярная биология и генетика, биохимия и энзимология, нейрофизиология и биофизика. Использование методологии точных наук (физики, химии, математики) позволило исследователям характеризовать различные жизненно важные процессы на уровне межмолекулярных взаимодействий. Расшифровка структуры ДНК и РНК, процесса реализации генетической информации привело к разработке так называемой ДНК-технологии, которая предоставила возможность исследователю работать с отдельными генами - конкретными участками генетического материала.

В результате появился высокоэффективный инструмент экспериментального изучения генетического материала: его организации, функционирования, взаимодействия различных элементов и эволюции. Для ряда наиболее генетически изученных организмов удалось получить, образно говоря, «чертежи» их генома.

Когда были разработаны методики выделения отдельных генов, подобраны условия сохранения их стабильности и определены закономерности переноса генов, появилась реальная возможность конструирования рекомбинантной ДНК (создание рекомбинантной ДНК буквально означает объединение (рекомбинирование) двух отрезков ДНК разных видов). По сути дела, наследственная изменчивость стала формироваться целенаправленно по воле и желанию человека, и были получены организмы, обладающие таким сочетанием генов (и соответственно, признаков), которые отсутствуют в природе.

В настоящее время для многих специалистов методы генной инженерии - методы рекомбинантных ДНК - являются краеугольным камнем здания биотехнологии.

Использование методов генной инженерии предполагает направленное, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм.

Использование методологии генной инженерии в прикладном аспекте предполагает конструирование таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Благодаря этому решаются многие прикладные проблемы: получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, нарабатывающих фармакологически значимые для человека белковые препараты, создание высоко продуктивных пород животных с определёнными ценными для человека признаками, выведение растений, устойчивых к различным патогенам и вредителям и так далее. С этими же наукоёмкими технологиями связана и генетическая паспортизация, и диагностика генетических заболеваний, и создание ДНК-вакцин, и терапия различных заболеваний. Таким образом, сложившаяся благоприятная ситуация в биологии явилась мощным толчком в развитии современной биотехнологии, весьма важной области практического приложения результатов фундаментальных наук.

1. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦиГСО РАН, 1993. – 241 с.

2. Барановов В.С. Генная терапия – медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал. № 3. 1999. С. 3 – 68.

3. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. 334 с.

4. Глебов О.К. Генетическая трансформация соматических клеток // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988.

5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.

6. Егоров Н.С., Самуилов В.Д. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов // Биотехнология. Кн. 2. М.: Высшая школа, 1988. 208 с.

7. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. – Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.

8. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генная инженерия растений. М.: Наука, 1985. 280 с.

Получение рекомбинантной ДНК в искусственных условиях и клонирование генов впервые было осуществлено в 1972 г. американскими учёными Бойером и Коэном.

В этой молекулярной конструкции ДНК плазмиды выполняет векторную (направляющую) функцию, поскольку плазмиды могут рекомбинироваться в хромосомной ДНК. Эта векторная конструкция в силу наличия в ней гена устойчивости к антибиотикам была введена в бесплазмидную, т. е. неустойчивую к антибиотикам бактериальную клетку . Бактерии с рекомбинантными плазмидами в силу того, что они имеют ген устойчивости к антибиотикам, в отличие от бесплазмидных бактерий, не погибают в питательной среде , содержащей антибиотик. Поэтому в опытную пробирку вводится антибиотик и выделяется клон рекомбинантной бактерии, который затем выращивается. В каждой бактерии, составляющей данный клон, будет содержаться отрезок чужой (гетерологичной) ДНК, и этот отрезок может размножаться по мере размножения бактериальной биомассы . Кроме того, если реком-бинантная плазмида обладает способностью к автономной репликации, то отрезок чужой ДНК может размножаться ещё десятки раз. Размножение чужой ДНК посредством векторной конструкции называется клонированием генов. В качестве вектора при клони-ровании отрезков ДНК могут быть использованы вирусные и фаговые молекулы ДНК или