Ферменты и их биохимическая роль. Строение ферментов

Ферменты и витамины

Роль биологических молекул, входящих в состав организма.

Лекция № 7

(2 часа)

Общая характеристика ферментов

Строение ферментов

Основные этапы ферментативного катализа

Свойства ферментов

Номенклатура и классификация ферментов

Ингибиторы и активаторы ферментов

Классификация витаминов

Жирорастворимые витамины

Витамины, растворимые в воде

Витамины группы В

Общие признаки ферментов и катализаторов неорганической природы:

Катализируют только энергетически возможные реакции,

Не изменяют направление реакции,

Не расходуются в процессе реакции,

Не участвуют в образовании продуктов реакции.

Отличия ферментов от небиологических катализаторов :

Белковое строение;

Высокая чувствительность к физико-химическим факторам среды, работают в более мягких условиях (Р атмосферное, 30-40 о С, рН близкое к нейтральному);

Высокая чувствительность к химическим реагентам ;

Высокая эффективность действия (могут ускорять реакцию в 10 8 -10 12 раз; одна молекула Ф может катализировать 1000-1000000 молекул субстрата за 1 мин);

Высокая избирательность Ф к субстратам (субстратная специфичность) и к типу катализируемой реакции (специфичность действия);

Активность Ф регулируется особыми механизмами.

По строению ферменты делятся на простые (однокомпонентные) и сложные (двукомпонентные). Простой состоит только из белковой части, сложный (холофермент ) - из белковой и небелковой частей. Белковая часть - апофермент , небелковая - кофермент (витамины В 1 , В 2 , В 5 , В 6 , Н, Q и др.). Отдельно апофермент и кофермент не обладают каталитической активностью. Участок на поверхности молекулы фермента, который взаимодействует с молекулой субстрата - активный центр.

Активный центр образован из остатков аминокислот, находящихся в составе различных участков полипептидной цепи или различных сближенных полипептидных цепей . Образуется на уровне третичной структуры белка-фермента. В его пределах различают субстратный (адсорбционный) центр и каталитический центр. Кроме активного центра встречаются особые функциональные участки - аллостерические (регуляторные) центры.

Каталитический центр - это область активного центра фермента, которая непосредственно участвует в химических преобразованиях субстрата. КЦ простых ферментов - это сочетание нескольких аминокислотных остатков, расположенных в разных местах полипептидной цепи фермента, но пространственно сближенных между собой за счет изгибов этой цепи (серин , цистеин , тирозин , гистидин , аргинин , асп. и глут. кислоты). КЦ сложного белка устроен сложнее, т.к. участвует простетическая группа фермента - кофермент (водорастворимые витамины и жирорастворимый витамин K).

Субстратный (адсорбционный) цент р - это участок активного центра фермента, на котором происходит сорбция (связывание) молекулы субстрата. СЦ формируется одним, двумя, чаще тремя радикалами аминокислот, которые обычно расположены рядом с каталитическим центром. Главная функция СЦ - связывание молекулы субстрата и ее передача каталитическому центру в наиболее удобном для него положении.

Аллостерический центр ("имеющий иную пространственную структуру") - участок молекулы фермента вне его активного центра, который обратимо связывается с каким-либо веществом. Такое связывание приводит к изменению конформации молекулы фермента и его активности. Активный центр либо начинает работать быстрее, либо медленнее. Соответственно такие вещества называют аллостерическими активаторами либо аллостерическими ингибиторами.

Аллостерические центры найдены не у всех ферментов. Они есть у ферментов, работа которых изменяется под действием гормонов, медиаторов и других биологически активных веществ.

Описание презентации ЛЕКЦИЯ № 1 Введение в биохимию. Ферменты по слайдам

План лекции I. Биохимия – как наука. Предмет, цели и задачи биохимии. II. Метаболизм. Основные понятия. Виды метаболических реакций. III. Энзимология. 1. Ферменты. Определение, химическая природа, физико-химические свойства, биологическое значение. 2. Сравнение ферментов и неорганических катализаторов 3. Строение ферментов

Биохимия – наука, изучающая вещества, входящие в состав живых организмов, их превращения, а также взаимосвязь этих превращений с деятельностью органов и тканей Биохимия – молодая наука, около ста лет назад она возникла на стыке физиологии и органической химии. Термин биохимия ввел в 1903 г немецкий биохимик Карл Нейберг (1877 -1956). I. БИОХИМИЯ

Биохимия как наука делится на: Статическую (биоорганическая химия) анализирует структуру и химический состав организмов Динамическую изучает обмен веществ и энергии в организме Функциональную исследует взаимодействие химических процессов с биологическими и физиологическими функциями OH H O H O HO HH HO HCO 2 + H 2 O ÀÄÔ + Ôí ÀÒÔ À Ò Ô À Ä Ô + Ô í

По объектам исследования, биохимия делится на: биохимию человека и животных; биохимию растений; биохимию микроорганизмов; биохимию грибов; биохимию вирусов. Мы с вами будем заниматься медицинской биохимией, одним из разделов биохимии человека и животных

Объектом медицинской биохимии является человек Целью курса медицинской биохимии является изучение: молекулярных основ физиологических функций человека; молекулярных механизмов патогенеза болезней; биохимических основ предупреждения и лечения болезней; биохимических методов диагностики болезней и контроля эффективности лечения (клиническая биохимия)Задачи курса медицинской биохимии: изучить теоретический материал; получить практический навык биохимических исследований; научиться интерпретировать результаты биохимических исследований

II. Метаболизм В основе жизнедеятельности любого организма лежат химические процессы. Метаболизм (обмен веществ) – совокупность всех реакций, протекающих в живом организме А FB C DЭнергия Тепло Катаболизм Анаболизм

Метаболиты – вещества, участвующие в метаболических процессах (субстраты, А, В, С, продукты) Субстрат – вещество, которое вступает в химическую реакцию Продукт – вещество, которое образуется в ходе химической реакции Субстрат Продукт. Последовательность реакций, в результате которых субстрат превращается в продукт называется метаболический путь А В СОрганические соединения имеют сложную структуру и синтезируются только в ходе нескольких последовательных реакций Пример метаболического пути: Гликолиз, цепь окислительного фосфорилирования

Субстрат Продукт 2 Последовательность реакций, идущие в обход основного метаболического пути называется метаболическим шунтом А ВD EПродукт 3 Продукт 1 Примеры метаболических шунтов: 1. пентозофосфатный шунт, 2. 2, 3 -дифосфоглицератный шунт

S 1 Последовательность реакций, в ходе которых образующийся продукт, является одновременно и субстратом данных реакций называется метаболическим циклом S 2(P) A CBПродукт 1 Продукт 2 Примеры метаболических циклов: 1. Цикл Кребса, 2. Орнитиновый цикл 3. Цикл β — окисления жирный кислот 4. Глюкозо-лактатный цикл, 5. Глюкозо-аланиновый цикл

Энзимология – наука, раздел биохимии, о ферментах. III. Энзимология строение и свойства ферментов; ферментативные реакции и механизмы их катализа; регуляцию активности ферментов. Предметом изучения энзимологии являются ферменты. Энзимология изучает: Медицинская энзимология — изучает применение ферментов в медицины.

Практически все реакции в живом организме протекают с участием ферментов Ферменты (энзимы) – биологические катализаторы белковой природы. Биологическая роль ферментов заключается в том, что они катализируют контролируемое протекание всех метаболических процессов в организме Физико-химические свойства Являясь веществами белкой природы, ферменты обладают всеми свойствами белков Определение и химическая природа К 2013 году было описано более 5000 разных ферментов

Особенности действия ферментов 1. Ускоряют только термодинамически возможные реакции 2. Не изменяют состояние равновесия реакций, а только ускоряют его достижение 3. реакции ускоряют значительно, в 10 8 -10 14 раз 4. Действуют в малых количествах 5. В реакциях не расходуются 6. Чувствительны к активаторам и ингибиторам. 7. Активность ферментов регулируется специфическими и неспецифическими факторами 8. Ферменты действуют только в мягких условиях (t = 36 -37ºС, р. Н ~ 7, 4, атмосферное давление) 9. Обладают широким диапазоном действия, катализируют большинство реакций в организме 10. Для ферментов характерна высокая специфичность субстратная специфичность: ▪ абсолютная (1 фермент — 1 субстрат), ▪ групповая (1 фермент – несколько похожих субстратов), ▪ стереоспецифичность (ферменты работают с субстратами L или D). каталитическая специфичность (ферменты катализируют реакции одного из типов химических реакций)О б щ ее с неорганическим и катал изаторам и

1. Активный центр – это часть молекулы фермента, которая специфически взаимодействует с субстратом и принимает непосредственное участие в катализе б). Каталитический центр. Активный центр, как правило, находиться в нише (кармане) Содержит, не менее трех точек для связывания субстрата, благодаря чему молекула субстрата присоединяется к активному центру единственно возможным способом, что обеспечивает субстратную специфичность фермента 1. Активный центр а). Субстратный участок (контактная площадка) Особенность строения каталитического центра дает возможность ферменту катализировать реакцию с помощью определенного механизма катализа: кислотно-основного, электрофильного, нуклеофильного и т. д. Т. о. каталитический центр обеспечивает выбор пути химического превращения и каталитическую специфичность фермента. Строение ферментов Ферменты – глобулярные белки, содержащие активный центр

Фермен т +- 0 Субстрат Ферменты характеризуются наличием специфических центров катализа Субстратный участок Каталит. центр Активный центр + 0 -Продук т

02. Алостерический центр У группы регуляторных ферментов есть алостерические центры, которые находятся за пределами активного центра К алостерическому центру могут присоединяться “+” модуляторы (активаторы), увеличивающие активность ферментов. Алостерический центр и контактная площадка устроены аналогично + -0+ Активатор

02. Аллостерический центр Также к аллостерическому центру могут присоединяться “-” модуляторы (ингибиторы), угнетающие активность ферментов. -0+ Ингибитор —

По составу ферменты делятся на: Простые Состоят только из аминокислот -Сложные Состоят из: 1. Аминокислот; 2. Ионы металлов 3. Органических веществ небелковой природы 0+ Апофермент. Простетическая группа+ — 0 Белковая часть (из аминокислот) сложного фермента называют Апофермент Небелковую часть сложного фермента называют Простетическая группа Ионы металлов (кофакторы) Органических веществ небелковой природы (коферменты)

Коферменты — органические вещества небелковой природы, которые участвуют в катализе в составе каталитического участка активного центра фермента называют. Каталитически активную форму сложного белка называют холоферментом Холофермент = Апофермент + Кофермент. Кофакторы — ионы металлов, необходимые для проявления каталитической активности ферментов называют

В качестве коферментов функционируют: Витамины Активация Коферменты РР (никотиновая кислота) НАД + , НАДФ + В 1 (тиамин) В 2 (рибофлавин) Тиаминпирофосфат ФАД, ФМН В 6 (пиридоксаль) Пиридоксальфосфат В 12 Кобаламины Гемы (коферменты цитохромов); Нуклеотиды (коферменты рибосом); коэнзим Q ; ФАФС (коферменты трансфераз); SAM ; Глутатион (кофермент глутатионпероксидазы); Производные водорастворимых витаминов:

— 0+ +- 0++ — 0+ + — 0 Косубстрат – простетическая группа, которая присоединена к белковой части слабыми нековалентными связями. Косубстрат присоединяется к ферменту в момент реакции: Например, НАД + , НАДФ +. +- 0+ Продукт Фермент + Субстрат Фермент Косубстрат Фермент-субстратный комплекс Косубстрат- 0+Простетическая группа обычно прочно связана с апоферментом.

Кофакторы В качестве кофакторов выступают ионы калия, магния, кальция, цинка, меди, железа и т. д. стабилизируют молекулы субстрата и обеспечивают его связывание; стабилизируют активный центр фермента, стабилизируют третичную и четвертичную структуру фермента; обеспечивают катализ. Роль кофакторов разнообразна, они:

Например, АТФ присоединяется к киназам только вместе с Mg 2+ + Субстрат (АТФ)Кофактор (Mg 2+) + — 0 Фермент Активный субстрат (АТФ- Mg 2+) — 0+ + — 0+ Фермент-субстратный комплекс Продукт (АДФ) — 0+ Фермент. Кофактор (Mg 2+)

Локализация и компартментализация ферментов в клетке и тканях По локализации в организме ферменты делятся: Общие ферменты (универсальные) Органоспецифические ферменты Органеллоспецифические ферменты. Органеллонеспецифические ферменты. По локализации в клетке ферменты делятся: Креатинкиназы, аминотрансферазы и тд. Ферменты гликолиза, рибосомы и т. д.

Обнаруживаются практически во всех клетках, обеспечивают основные процессы жизнедеятельности клетки: 1. Общие ферменты (универсальные) Ферменты: гликолиза, цикла Кребса, окислительного фосфорилирования, ПФШ и т. д. Синтез и использование АТФ; метаболизм белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и других органических веществ; создание электрохимического потенциала; движение и т. д.

2. Органоспецифические ферменты Костная ткань Щелочная фосфатаза Миокард АСТ, АЛТ, КФК МВ, ЛДГ 1, 2 Почки Трансамидиназ а, щелочная фосфатаза Печень Аргиназа, АЛТ, АСТ, ЛДГ 4, 5 , щелочная фосфатаза, γ -глутамилтранспептидаза, глутаматдегидрогеназа холинэстераза. Свойственны определенным органам или тканям (или группе органов и тканей). Обеспечивают выполнение ими специфических функций Простата Кислая фосфотаза. Поджелудочная железа α-амилаза, липаза, γ -глутамилтранспептидаза

Распределение ферментов в органах печень миок. Скел. муск Почки Er Кость Простата АСТ АЛТ ЛДГ КФК ЩФ КФ 0 -10% 10 -50% 50 -75% 75 -100%

3. Органеллоспецифические ферменты Клеточная мембрана Щелочная фосфатаза, Аденилатциклаза, К-Nа-АТФаза Цитоплазма Ферменты гликолиза, ПФШ Гладкий ЭПР Ферменты микросомального окисления Рибосомы Ферменты биосинтеза белка. Лизосомы Кислая фосфатаза. Митохондрии Ферменты окислительного фосфорилирования, ЦТК, β-окисления жирных кислот Ядро РНК-полимераза, НАД-синтетаза

Изоферменты – это множественные формы одного фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, и отличающие химическим составом Изоферменты отличаются: сродством к субстрату (разные Км), максимальной скорости катализируемой реакции, электрофоретической подвижности, разной чувствительности к ингибиторам и активаторам, оптимуму р. Н термостабильности Изоферменты имеют четвертичную структуру, которая образована четным количеством субъединиц (2, 4, 6 и т. д.): Изоферменты У белков с четвертичной структурой и разными субъединицами за счет меньшего количества генов создается большее разнообразие форм.

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) ЛДГ состоит из 4 -х субъединиц 2 типов М (muscle) и Н (heart), которые в разных комбинациях образуют 5 изоформ М (muscle)Н (heart) В составе преобладают дикарбоновые АК В составе преобладают диаминомонокарбоновые АК Ë Ä ÃC O O H C C H 3 O Ï Ê 2 Í À Ä + 2 Í À Ä Í 2 C O O H C C H 3 O H Ë à ê ò à òH фермент гликолиза и глюконеогенеза

ЛДГ 1 НННН ЛДГ 2 НННМ ЛДГ 3 ННММ ЛДГ 4 НМММ ЛДГ 5 ММММ О 2 Н (heart) М (muscle) эпителий лёгочных альвеолмиокард, эритроциты, корковое вещество почек поперечно-пол осатая скелетная мускулатура, гепатоцитыр. Н нейтральная р. Н кислая

Креатинкиназа (креатинфосфокиназа) КФК состоит из 2 -х субъединиц 2 типов М (от англ, muscle — мышца) и В (от англ, brain — мозг) , которые в разных комбинациях образуют 3 изоформы: КФК ВВ КФК ММКФК играет важную роль в энергетическом обмене мышечной и нервной тканей

Определение в крови активности органо- органеллоспецифических ферментов и изоферментов широко используется в клинической диагностике: Инфаркт миокарда АСТ, АЛТ, КФК МВ, ЛДГ 1, 2 Панкреатит Панкреатическая амилаза, γ -глутамилтранспептидаза, липаза Гепатит АЛТ, АСТ, ЛДГ 4, 5 , γ -глутамилтранспептидаза, глутаматдегидрогеназа

Номенклатура – названия индивидуальных соединений, их групп, классов, а также правила составления этих названий Классификация – разделение чего-либо по выбранным признакам Номенклатура и классификация ферментов

Современная номенклатура ферментов – международная, переведена на разные языки Исторически сложившиеся названия: (пепсин, трипсин) рабочие названия: субстрат + окончание аза (сахараза) субстрат + его хим. превращение + аза (пируваткарбоксилаза) Тривиальная Систематическая По названию можно точно идентифицировать фермент и его катализируемую реакцию. В каждом классе строится по определённой схеме Принята в 1961 г Международным союзом биохимиков

Классификация ферментов На основании 6 известных типов химических реакций ферменты, которые их катализируют, подразделяют на 6 классов. На основании субстратов, переносимых групп и т. д. в каждом классе выделяют несколько подклассов и поподклассов (от 5 до 23); Каждый фермент имеет свой шифр КФ 1. 1. Первая цифра обозначает класс, вторая — подкласс, третья — подподкласс, четвертая — порядковый номер фермента в его подподклассе (в порядке открытия). http: //www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/

№ Тип реакции Класс Подкласс Поподкласс 1 ОРВ Оксидоредуктазы 23 подклассов Оксидазы Аэробные ДГ Анаэробные ДГ Оксигеназы Гидроксипероксидазы 2 переноса функциональных групп Трансферазы 10 подклассов Киназы Аминотрасферазы Протеинкиназы Гексокиназы 3 Гидролитическое удаление группы от субстрата Гидролазы 13 подклассов Фосфотазы ФПФ 4 Негидролитическое удаление группы от субстрата Лиазы 7 подклассов 5 изомеризация изомеразы 5 подклассов 6 синтеза за счет энергии макроэргических соединений лигазы 6 подклассов C-O-лигаза, C-S-лигаза, C-N-лигаза, C-C-лигаза

Номенклатура ферментов В правилах названия ферментов нет единого подхода – в каждом классе свои правила Название фермента состоит из 2 частей: 1 часть – название субстрата (субстратов), 2 часть – тип катализируемой реакции. Окончание – АЗА; Дополнительная информация, если необходима, пишется в конце и заключается в скобки: L -малат + НАДФ + ↔ ПВК + СО 2 + НАДН 2 L -малат: НАДФ+ — оксидоредуктаза (декарбоксилирующая);

1. Оксидоредуктазы Название класса: донор: акцептор (косубстрат) оксидоредуктаза R — CH 2 — O H + НАД + R — CH =О + НАД Н 2 Систематическое название: Алкоголь: НАД + оксидоредуктаза Тривиальное название: алкогольдегидрогеназа Шифр: КФ 1. 1 ℮ — и Н +

2. Трансферазы Название класса: откуда: куда в какое положение – что – трансфераза донор: акцептор – транспортируемая группа – трансфераза АТ Ф + D -гексоза АДФ + D -гексоза -6 ф Систематическое название: АТ Ф: D -гексоза -6 — фосфо трансфераза Тривиальное название: гексокиназа Шифр: КФ 2. 7. 1. 1 Атомы и молекулярные остатки

3. Гидролазы Название класса: Субстрат – что отщепляется –гидролаза Субстрат –гидролаза Ацетилхолин + Н 2 О Ацетат + Холин Систематическое название: Ацетилхолин -ацил гидролаза Тривиальное название: Ацетилхолинэстераза Шифр: КФ 3. 1. 1.

4. Лиазы Название класса: субстрат: что отщепляется –лиаза L-малат Н 2 О + фумарат Систематическое название: L-малат: гидро –лиаза Тривиальное название: фумараза Шифр: КФ 4. 2. 1.

5. Изомеразы Название класса: Субстрат – вид изомеризации – изомераза Субстрат – продукт – изомераза Фумаровая к-та Малеиновая к-та Систематическое название: Фумарат –цис, транс–изомераза

6. Лигазы (синтетазы) Название класса: субстрат: субстрат – лигаза (источник энергии) L-глутамат + NH 4 + + АТФ L-глутамин + АДФ + Фн Систематическое название: L-глутамат: аммиак – лигаза (АТФ → АДФ + Фн) Тривиальное название: глутаминсинтетаза Шифр: КФ 6. 3. 1.

Ферменты.

Ферменты – органические вещества белковой природы являющиеся биологическими катализаторами.

По химической природе – глобулярные белки ускоряют химические реакции в тысячи раз

Открыл Константин Кирхгоф, 1814г (превращал крахмал в сахар под действием амилазы) Некоторые ферменты состоят только из белков, но большинство кроме белковой части (апофермента) имеют и не белковый компонент (ко фактор). Ко фактором могут быть неорганические ионы или органические соединения. Если белковая часть фермента слабо связана с ко фактором и фермент активируется только при присоединении этой части, то ко фактор называют ко ферментом. Часто ко ферментом являются нуклеотиды и витамины, молекулы всех ферментов имеют 1 или несколько активных центров. Активным центром присоединяется к субстрату, остальная часть фермента служит для подержания структуры активного центра. В состав активного центра входят ко факторы и ко ферменты.

Действие фермента в клетке всегда строго согласовано происходит в определенной последовательности по принципу «ключа и замка».

1 Классификация ферментов.

1 Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции (оксидазы, дегидрогеназы, пироксидазы)

2 Трансферазы – катализируют перенос атомных групп с одной молекулы на другую (аминотрансферазы – перенос NH2 группы при переаминировании аминокислот).

3 Гидролазы – ускоряют гидролиз (амилазы, липазы).

4 лиазы – ускоряют негидролитический распад по связям С-С, С-О (декарбоксилаза отщепляет СО2 от ПВК с образованием уксусного альдегида).

5 изомеразы – ускоряют превращение изомеров.

6 лигазы (синтетазы).

Классы подразделяются на подклассы и подподклассы. Каждый извлеченный фермент имеет свой шифр, содержащий 4 числа. Первая цифра указывает класс, вторая – подкласс, третья – подподкласс и четвертая указывает порядковый номер в подподклассе.

Пример: шифр 3.5.3.1.

3 подкласс гидролаз; 5 действующая на C-N связи; 3 расщепляющий эти связи в линейных, а не циклических соединениях.

2 механизмы катализа. Кинетика и регуляция ферментативных реакций.

Механизм действия ферментов:

Фермент + Субстрат---Субстрат комплекс---Фермент + Продукт реакции

В основе механизма лежит образование промежуточного фермент-субстратного комплекса, в котором вещество связано с активным центром фермента при образовании комплекса, молекула субстрата подвергается деформации, электрическое поле фермента меняет пространственную конфигурацию субстрата. Происходит перераспределение полярности, электронной плотности, связи субстрата разрыхляются, прочность снижается. Ферментный субстрат комплекс становится не стабильным превращаясь в комплекс ферментов - продукт, в котором продукт уже не соответствует активному центру и комплекс распадается на ферменты и продукты реакции.

3 Энергия активации.

Минимальное количество энергии которой должна обладать частица для того чтобы произошла химическая реакция называют Энергией активации. Чем больше эта энергия, тем меньше скорость реакции. Активация происходит при нагревании, поглощении лучистой энергии столкновения с возбужденными частицами, увеличение плотности в живых организмах, большие колебания температуры и плотности невозможны, поэтому энергетический барьер снижают ферменты, понижая энергию активации они увеличивают скорость реакции до 1012 раз.

4 Единицы измерения активности ферментов.

Ускорение реакции при участии ферментов очень велико, измеряется числом оборотов - числом молей субстрата, превращающих за 1 минуту 1 молем ферментов.. так число оборотов у альфа мелазы 40 тыс., изомеразы 500 тыс., каталазы 5млн.

Для оценки активности ферментативных препаратов используют понятие Молекула активации – число молекул субстрата превращаемых за 1 минуту 1 молекулой фермента. За стандартную единицу, для любого фермента, принимается такое количество ферментов, которое катализирует превращение1 микро моля субстрата за 1 минуту при оптимальных условиях(обычно 30 0С, оптимальная PH, оптимальная концентрация субстрата)

5 Зависимость скорости реакции от температуры и реакции среды.

1 от температуры.

Влияние температуры может быть выражено через температурный коэффициент Q10

Q10 =скорость реакции при (х+10)0С/скорость реакции при х ОС

В приделах интервала от 0-25-35 ОС Q10 = 2-3. при дальнейшем повышении температуры скорость увеличивается, и после достижения температурного порога, различного для каждого фермента, скорость начинает быстро падать. За пределами этого порога скорость снижается не смотря на увеличение частоты столкновения молекул. Причина – разрушение структуры белковой части ферментов (денатурация).

Чувствительность фермента к высокой температуре называют Термолабильность . Понижение температуры вызывает постепенную инактивацию фермента без его денатурации.

2 реакция среды.

При оптимальной температуре любой фермент наиболее эффективно работает в узких пределах PH. Большинство ферментов наиболее активны при PH=7, т. е. нейтральной среде. Даже незначительный сдвиг PH изменяет заряд ионизированных кислотных и основных групп, как самого фермента так и субстрата.

От резких сдвигов PH фермент может денатурировать.

Внутриклеточная PH всегда оптимальна для фермента, тем самым путем изменения клеткам удается регулировать активность ферментов.

6 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и субстрата.

1 концентрация фермента.

При увеличении количества ферментов скорость реакции повышается до того предела, который характеризуется количеством субстрата доступным действию ферментов. Ф оптимальных условиях скорость реакции пропорциональна концентрации ферментов. Многие ферменты могут не проявлять своей максимальной активности в клетках только из-за нехватки соответствующего субстрата.

2 концентрация субстрата.

При постоянной концентрации фермента увеличивается количество субстрата, что приводит в начале к быстрому, а затем более медленному росту скорости реакции, пока не достигается максимальная скорость, которая почти не изменяется при дальнейшем увеличении концентрации субстрата.

Скорость не изменяется так как активные центры фермента оказываются насыщенными субстратом в любой момент времени. Данная зависимость описывается уравнением Михаэлиса-Ментен.

Е+S---ЕS---Е+Р

V – скорость реакции;

Vmax – максимальная скорость реакции при бесконечно большой концентрации субстрата;

S – концентрация субстрата, моль/л;

Km – константа Михаэлиса-Ментен соответствующая концентрации субстрата при которой скорость реакции равна половине максимума;

Km - константа диссоциации комплекса фермента + субстрата: чем меньше диссоциация ферментного субстратного комплекса, тем выше скорость реакции.

7 Ингибиторы ферментативных реакций.

Ингибиторы - Вещества подавляющие действие ферментов.

Делятся на 2 класса:

1 общие ингибиторы (соли тяжелых металлов, свинца, ртути, вольфрама и серебра; трихлоруксусная кислота) эти соединения вызывают денатурацию белка, подавляют действие всех ферментов.

2 специфические – действуют на одну группу ферментативных реакций или группу близких реакций. Действие основано на специальном связывании с определенными химическими группировками в активном центре фермента. Все их делят на конкурентные и не конкурентные ингибиторы.

Конкурентное ингибирование.

Происходит когда ингибитор близок по своей структуре к обычному субстрату данного фермента. Сам ингибитор не может прореагировать, однако занимая активный центр преграждает к нему доступ настоящего субстрата.

В цикле Кребса фермент сукцинамдегидрогеназы катализирует окисление янтарной кислоты до фумаровой кислоты. Однако если в среду попадает малоновая кислота, то скорость окисления резко падает. Причина – близость по структуре этих кислот окислять.

Малоновую кислоту фермент не может и данный комплекс какое то время существует, т. е. происходит конкуренция кислот за активный центр фермента, при введении в среду большого количества янтарной кислоты повышается вероятность попадания в активный центр настоящего субстрата, а не ингибитора.

Не конкурентное ингибирование.

Как правило такое ингибирование не обратимо. Ингибиторы данного рода неродственны по структуре субстрату и в образовании комплекса с ферментом они занимают не активный центр, а другую часть молекулы фермента. При этом глобулярная структура фермента изменяется, изменяется полярность, и хотя субстрат присоединяется к активному центру реакция не происходит. Пример: цианид действует на ферменты дыхания (цитохромоксидазу) связываясь с входящими в ее состав ионами меди, реакция подавляется, дыхание прекращается, клетки погибают очень быстро.

8Активаторы ферментативных реакций. Активация и ингибирование по принципу обратной связи.

Активаторами часто являются ионы и соединения (К+, Са2+ ,СО2+ и др). Для пероксидазы и каталазы – Fe, для липазы –Са, для амилазы - CL. Многие ферменты вырабатываются клетками в не активной форме – проферменты. Переход проферментов в активные формы происходит под действием активаторов, механизм действия различный, в одних случаях активатор освобождает активные центры ферментов от ингибитора, в других – присоединяясь к белку изменяет его структуру, чем активирует активный центр. В третьих облегчает образование фермент-субстратного комплекса, когда конечный продукт начинает накапливаться, он сам может оказывать каталитические действия. Так небольшое количество пепсинов может стать катализатором превращения пепсиногена в пепсин.

Данный вид активации называют активным по принципу обратной связи или автоактивации.

Продукты реакции могут не только активировать, но и ингибировать ферментативный процесс, такое явление называют Ингибированием по принципу отрицательной обратной связи.

Так фермент фосфофруктокеназа участвует в реакциях гликолиза, ингибируется если концентрация АТФ высокая. Если уровень метаболизма высокий и качество АТФ понижается, то активность фермента восстанавливается.

9 Регуляция метаболизма. Мульти ферментные комплексы.

В типичной клетке более 500 ферментов, их активность и концентрация все время изменяется. Регуляция и согласованность процесса метаболизма обусловлены специфическим действием метаболизма, их пространственной организации и функциональности взаимодействия с клеткой компонентами.

Перечисленные особенности четко прослеживают существующих в клетках 2 типах метаболических путей:

1 линейный – некоторые ферменты действуют организованно будучи объединенными друг с другом в мульти ферментные комплексы, обычно эти комплексы связаны с мембраной. линейные расположения создают возможность саморегуляции путем ингибирования по принципу отрицательной обратной связи, т. е. скорость реакции зависит от концентрации конечного продукта.

Такая тесная связь понижает до минимума воздействие других реакций. Каждый фермент связан с соседними и продукт одного из них становится субстратом для следующего.

2 разветвленный метаболический путь.

Такой путь может привести к разным конечным продуктам и какой из них образуется зависит от условий существующих в клетке на данный момент. Регуляция образования конечного продукта осуществляется ингибированием по принципу обратной связи. Здесь также действуют мульти-ферментные системы, но ферменты находятся в растворе и тесно друг с другом не связаны.

Такую систему можно встретить в матриксе митохондрий, где происходят реакции цикла Кребса. Продукты некоторых реакций могут изыматься из ц. Кребса.

ФЕРМЕНТЫ

Функции ферментов сводятся к ускорению химических реакций, причем ферменты отличаются от других катализаторов тремя уникальными свойствами:

∙ высокой эффективностью действия;

∙ специфичностью действия;

∙ способностью к регуляции;

	Тип катализируемой реакции
Оксидоредуктазы	Окислительно-
	восстановительные реакции.
	Перенос отдельных групп атомов
Трансферазы		донорной		молекулы
	акцепторной молекуле.
Гидролазы	Гидролитическое (с				участием
	воды) расщепление связей.
	Расщепление				способом,
	отличным от			гидролиза
	окисления.
Изомеразы	Взаимопревращение				различных
	изомеров.
	Образование				в реакции
Лигазы (синтетазы)	конденсации				различных
	соединений			(используется
	энергия АТР).

В живой клетке множество разнообразных соединений, но реакции между ними не беспорядочны, а образуют строго определенные метаболические пути, характерные для данной клетки. Индивидуальность клетки в большой степени определяется уникальным набором ферментов, который она генетически запрограммирована производить. Отсутствие даже одного фермента или какой-нибудь его дефект могут иметь очень серьезные отрицательные последствия для организма.

Кофакторы ферментов

Все ферменты относятся к глобулярным белкам, причем каждый фермент выполняет специфическую функцию, связанную с присущей ему глобулярной структурой. Однако активность многих ферментов зависит от небелковых соединений, называемых кофакторами. Молекулярный комплекс белковой части (апофермента) и кофактора называется холоферментом. Роль кофактора могут выполнять ионы металлов (Zn2+ , Mg2+ , Mn2+ , Fe2+ , Cu2+ , K+ , Na+ ) или сложные органические соединения. Органические кофакторы обычно называют коферментами, некоторые из них являются производными витаминов. Тип связи между ферментом и коферментом может быть различным. Иногда они существуют отдельно и связываются друг с другом во время протекания реакции. В других случаях кофактор и фермент связаны постоянно и иногда прочными ковалентными связями. В последнем случае небелковая часть фермента называется простетической группой.

Некоторые коферменты

	Кофермент		Общая роль
						предшественник
	NAD+ , NADP+			водорода		Никотиновая кислота -
			(электронов)			витамин РР
				водорода		Рибофлавин - витамин
			(электронов)
	Кофермент А		Активация и			Пантотеновая кислота

			ацильных групп
			Связывание СО2
	Пиридоксальфосфат		Перенос аминогрупп		Пиридоксин - витамин
	Тетрагидрофолиевая
			одноуглеродных		Фолиевая кислота
			фрагментов

Роль кофактора в основном сводится к следующему:

∙ изменение третичной структуры белка и создание комплементарности между ферментом и субстратом;

∙ непосредственное участие в реакции в качестве еще одного субстрата.

В этой роли обычно выступают органические коферменты. Их участие в реакции иногда сводится к тому, что они выступают как доноры или акцепторы определенных химических групп.

Механизмы действия ферментов

Первоначальным событием при действии фермента является его специфическое связывание с лигандом - субстратом (S). Это происходит в области активного центра, который формируется из нескольких специфических R-групп аминокислот, определенным образом ориентированных в пространстве.

Важнейшие аминокислотные остатки в активном центре лизоцима

У некоторых ферментов в активном центре располагается и кофактор. Одни R- группы активного центра принимают участие в связывании субстрата, другие - в катализе. Некоторые группы могут делать и то, и другое. Детальный механизм действия каждого фермента уникален, но есть общие черты в «работе» ферментов, которые заключаются в следующем: высокая избирательность действия фермента обеспечивается тем, что субстрат связывается в активном центре фермента в нескольких точках и это исключает ошибки; активный центр располагается в углублении (нише) поверхности фермента и имеет комплементарную субстрату конфигурацию. В результате субстрат окружается функциональными группами активного центра фермента и изолируется от водной среды. Связывание субстрата с ферментом часто вызывает конформационные изменения, что ведет к правильному (оптимальному) расположению аминокислотных остатков, требуемому для протекания катализа, и тем самым увеличивает специфичность фермент-

субстратного взаимодействия (индуцированное соответствие). Так как максимальная активность фермента обусловлена оптимальной конформацией молекулы фермента в целом и активного центра в частности, то даже небольшие изменения окружающих условий, которые затрагивают связывание субстрата или конформацию третичной структуры белка, будут влиять на скорость ферментативной реакции. Например, изменение рН приводит к изменению степени ионизации ионогенных групп фермента и, следовательно, ведет к перераспределению межрадикальных связей в третичной структуре. Оптимальное рН для каждого фермента означает некоторое оптимальное состояние его ионизации, соответствующее наилучшей комплементарности. Изменение температуры вызывает противоречивый эффект: с одной стороны, при повышении температуры до 37 - 40о скорость ферментативной реакции увеличивается, что закономерно для катализа; с другой стороны, при температуре более 50о начинается денатурация фермента.

Кинетика ферментативных реакций определяется образованием ферментсубстратного комплекса:

Где Е - фермент, S - субстрат, ES - ферментсубстратный комплекс, реакция образования которого обратима и характеризуется константами К1 и К-1 соответственно.

Распад фермент-субстратного комплекса протекает по уравнению первого порядка, он практически необратим и характеризуется константой скорости К2. Эта стадия процесса является более медленной, т.е. лимитирующей. Начальная скорость (Vo). При обычных условиях, когда [S] >> [E], начальная скорость прямо пропорциональна концентрации фермента. Максимальная скорость (Vmax). При фиксированной концентрации фермента, скорость реакции стремится к конечному максимальному значению, в то время как концентрация субстрата растет. Насыщение фермента субстратом наступает, когда весь фермент включен в фермент-субстратный комплекс. Константа Михаэлиса (Km). В случае, когда все активные центры заняты, и свободные молекулы фермента отсутствуют, Vo=Vmax. При таком условии говорят о 100% насыщении. При 50% насыщении, когда Vo=1/2 Vmax из уравнения Михаэлиса - Ментен следует: Vmax / 2 = Vmax [S] / Km + [S], или в преобразованном виде: Km + [S] = 2 [S]; Km = [S]. Следовательно, Km имеет размерность концентрации. Таким образом, Кm – это такая концентрация субстрата, которая необходима для связывания половины имеющегося фермента и достижения половины максимальной скорости. Из этого определения следует, что Km можно использовать для оценки сродства фермента по отношению к данному субстрату. Оценить субстратную специфичность можно по такому правилу: чем ниже значение Km, тем лучше (предпочтительнее) субстрат для данного фермента. Km и Vmax - кинетические параметры, отражающие механизмы действия фермента.

Кинетика ферментативных реакций

Vmax отражает эффективность действия фермента. Для сравнения каталитической активности различных ферментов необходимо выразить Vmax через количество каждого фермента. Такое преобразование приводит к величине, которую называют молярной активностью (или числом оборотов фермента). Она выражается числом моль субстрата, реагирующего с одним моль фермента за единицу времени. Активность фермента можно выразить также в единицах (ед. или Е) активности. Одна единица катализирует превращение субстрата со скоростью1 мкмоль /мин. Удельная активность - это активность в единицах, отнесённая к 1 мг белка.

Ингибиторы ферментов

Действие ферментов можно полностью или частично подавить (ингибировать) определенными химическими веществами (ингибиторами). По характеру действия ингибиторы могут быть обратимыми и необратимыми. В основе этого деления лежит прочность соединения ингибитора с ферментом. Другой способ деления ингибиторов основывается на характере места их связывания. Одни из них связываются с ферментом в активном центре, а другие - в удаленном от активного центра месте. Они могут связывать и блокировать функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявления его активности. При этом они необратимо, часто ковалентно, связываются с ферментом или фермент - субстратным комплексом и необратимо изменяют нативную конформацию. Это, в частности, объясняет действие Hg2+ , Pb2+ , соединений мышьяка. Ингибиторы такого рода могут быть полезны при изучении природы ферментативного катализа. Например, диизопропилфторфосфат ингибирует ферменты, имеющие серин в активном центре. Таким ферментом является ацетилхолинэстераза, катализирующая следующую реакцию:

Реакция происходит каждый раз после проведения нервного импульса, прежде чем второй импульс будет передан через синапс. Диизопропилфторфосфат - одно из отравляющих веществ нервно-паралитического действия, так как приводит к утрате способности нейронов проводить нервные импульсы.

Действие диизопропилфторфосфата на фермент

Терапевтическое действие аспирина как жаропонижающего и противовоспалительного средства объясняется тем, что аспирин ингибирует один из ферментов, катализирующий синтез простагландинов (ПГ). Простагландины - вещества, участвующие в развитии воспаления. Ингибирование обусловлено ковалентной модификацией одной из аминогрупп фермента - простагландинсинтетазы.

Взаимодействие аспирина с ферментом простагландинсинтетазой

Обратимые ингибиторы. Существует два типа подобных ингибиторов - конкурентные и неконкурентные. Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром. Это происходит потому, что ингибитор и субстрат имеют сходные структуры:

Конкурентное ингибирование: S- субстрат, I- ингибитор (своей трехмерной структурой похож на субстрат).

В отличие от субстрата связанный с ферментом конкурентный ингибитор не подвергается ферментативному превращению. Более того, образование EI уменьшает число молекул свободного фермента, и скорость реакции снижается. Связывание S и I происходит взаимоисключающим образом. Образуется либо ES, либо EI, но не EIS. Так как конкурентный ингибитор обратимо связывается с ферментом, то можно сдвинуть

равновесие реакции E + I ↔ EI влево простым увеличением концентрации субстрата. Конкурентными ингибиторами являются многие химиотерапевтические средства. Например, сульфамидные препараты, используемые для лечения инфекционных болезней. Сульфаниламиды – это структурные аналоги парааминобензойной кислоты, из которой в клетке микроорганизма синтезируется кофермент (Н4 - фолат), участвующий в биосинтезе нуклеиновых оснований. Нарушение синтеза нуклеиновых кислот приводит к гибели микроорганизмов.

Неконкурентное обратимое ингибирование не может быть ослаблено или устранено повышением концентрации субстрата, так как эти ингибиторы присоединяются к ферменту не в активном центре, а в другом месте.

E + S ↔ ES → E + P; E + I ↔ EI; ES + I → ESI. Неконкурентное обратимое ингибирование

Связывание приводит к изменению конформации фермента и нарушению комплементарности к субстрату. Неконкурентные ингибиторы могут обратимо связываться как со свободным ферментом, так и с комплексом ES. Наиболее важными неконкурентными ингибиторами являются образующиеся в живой клетке промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связываться с определенными участками ферментов (аллостерические центры) и изменять их активность, что является одним из способов регуляции метаболизма. Исследование действия ингибиторов используется при изучении механизма действия фермента, кроме того, помогает в поисках более эффективных лекарственных средств, так как лечебное действие многих лекарств обусловлено тем, что они являются ингибиторами определенных ферментов. Структурные аналоги коферментов тоже могут быть ингибиторами. Кинетические тесты позволяют отличить конкурентное ингибирование от неконкурентного.

Зависимость I/V от I/S. 1 - без ингибитора, 2 - в присутствии ингибитора (а - конкурентное; б - неконкурентное ингибирование)

Регуляция действия ферментов

В живой клетке скорость ферментативных реакций находится под строгим контролем, что позволяет каждой метаболической цепочке реакций постоянно изменяться, приспосабливаясь к меняющимся потребностям клетки в продукте.

Метаболическая цепь: А, В, С, D - метаболиты, Е1, Е2, Е3, Е4 - ферменты

В каждой метаболической цепи есть фермент, который задает скорость всей цепочке реакций. Он называется регуляторным ферментом. Существует несколько способов регуляции действия ферментов:

∙ изменение активности фермента при его постоянной концентрации;

∙ изменение концентрации фермента, обычно в результате ускорения (индукции) или торможения (репрессии) синтеза фермента;

Основные способы регуляции активности ферментов

Аллостерическая регуляция . Фермент изменяет активность с помощью

нековалентно связанного с ним эффектора. Связывание происходит в участке, пространственно удаленном от активного (каталитического) центра. Это связывание вызывает конформационные изменения в молекуле белка, приводящие к изменению определенной геометрии каталитического центра. Активность может увеличиться - это активация фермента, или уменьшиться - это ингибирование.

Аллостерическая активация фермента

«Сообщение» о присоединении аллостерического активатора передается посредством конформационных изменений каталитической субъединице, которая становится комплементарной субстрату, и фермент «включается». При удалении активатора фермент вновь переходит в неактивную форму и «выключается». Аллостерическая регуляция является основным способом регуляции метаболических путей.

Регуляция активности ферментов путем фосфорилированиядефосфорилирования . Фермент изменяет активность в результате ковалентной модификации.

Регуляция активности липазы

В этом случае фосфатная группа - ОРО 3 2- присоединяется к гидроксильным группам

в остатках серина, треонина или тирозина. В зависимости от природы фермента фосфорилирование может его активировать или, наоборот, инактивировать. Реакция присоединения фосфатной группы и ее отщепление катализируют специальные ферменты - протеинкиназы и протеинфосфатазы.

Регуляция путем ассоциации-диссоциации субъединиц в олигомерном ферменте.

Этот процесс иногда начинается с ковалентной или нековалентной модификации одной из субъединиц. Например, фермент протеинкиназа в неактивной форме построена как тетрамер R2C2 (R и С - разные субъединицы). Активная протеинкиназа представляет собой субъединицу С, для освобождения которой необходима диссоциация комплекса. Активация фермента происходит при участии cAMP (циклоаденозинмонофосфорная кислота), которая способна присоединиться к субъединице R, после чего изменяется конформация, комплементарность субъединиц R и С и происходит диссоциация комплекса: R2C2 + 2cАМР 2С + 2(R -сАМР) Циклический АМР является продуктом АТР, превращение которой катализирует фермент аденилатциклаза: АТРс АМР + Н4 Р2 О7

Аденилатциклазная система . Аденилатциклаза и протеинкиназа катализируют взаимосвязанные реакции, которые составляют единую регуляторную систему.

Аденилатциклазная система

С помощью этой системы в клетку передаются сигналы из внеклеточной среды, и в нужном направлении изменяется метаболизм клетки. Внеклеточным вестником сигнала могут быть разные молекулы, в том числе и гормоны. Эти молекулы не проникают внутрь клетки, но «узнаются» мембранными рецепторами. При активации аденилатциклазы происходят следующие этапы:

∙ изменение конформации рецептора после присоединения к нему сигнальной молекулы и увеличение его сродства к регуляторному G-белку. В результате образуется комплекс рецептора и протомеров G-белка;

∙ образование этого комплекса приводит к изменению конформации a -протомера G- белка, который теряет сродство к GDP и происходит замена GDP на GTP. В результате комплекс протомеров G-белка распадается;

∙ a -протомер взаимодействует с аденилатциклазой, что ведет к изменению ее конформации и как следствие этого - активации;

∙ после этого аденилатциклаза катализирует синтез cAMP, который в свою очередь активирует cAMP-зависимую протеинкиназу. Активация последней связана с диссоциацией комплекса входящих в нее протомеров после присоединения cAMP. Протеинкиназа фосфорилирует соответствующие ферменты, изменяет их активность и, следовательно, скорость метаболизма в клетке.

Активация ферментов путем частичного протеолиза. Некоторые ферменты

синтезируются первоначально неактивными и лишь после секреции из клетки переходят в активную форму. Неактивный предшественник называется проферментом. Активация профермента включает модификацию первичной структуры с одновременным изменением конформации. Например, трипсиноген, синтезированный в поджелудочной железе, затем в кишечнике превращается в трипсин путем удаления фрагмента с N-конца: энтеропептидаза трипсиногентрипсин + Val-(Acn) -Lys Расщепление определенных пептидных связей «запускает» новые взаимодействия R-групп по всей молекуле, приводя к новой конформации, в которой R-группы активного центра занимают оптимальное положение для катализа. Нарушения структуры какого-либо фермента, ведущие к снижению его активности, приводят к нарушению метаболических путей, в которых участвует этот фермент. Такие нарушения почти всегда проявляются как болезни. Повреждения ферментов бывают двух типов: наследственные дефекты строения фермента и повреждения, вызванные попадающими в организм токсическими веществами, ингибирующими фермент.

ЛЕКЦИЯ № 2

ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава РФ
Кафедра биохимии
Дисциплина: Биохимия
ЛЕКЦИЯ № 2
Ферменты 2.
Лектор: Гаврилов И.В.
Факультет: лечебно-профилактический,
Курс: 2
Екатеринбург, 2015г

План лекции

1.
2.
3.
Кинетика ферментативных реакций.
Регуляция скорости ферментативных реакций.
Клеточная сигнализация

Энзимология – наука,
изучающая ферменты

1. Кинетика
ферментативных реакций
Кинетика ферментативных реакций направление энзимологии, исследующее
влияния реагирующих веществ (субстраты,
продукты, ингибиторы, активаторы и т.д.) и
условий (рН, t°, давление) на скорость
ферментативной реакции.

Теории о механизмах действия ферментов

Теории о специфичности
действия ферментов
1. Модель «ключ – замок»
Для объяснения высокой специфичности ферментов по
отношению к субстратам Эмиль Фишер в 1894г выдвинул
гипотезу о строгом соответствии геометрической формы
субстрата и активного центра фермента.
+
E+S
ES
E
Р1
+
Р2

2. Теория «индуцированного соответствия»
S
A
B
E
A
B
C
C
Существует не только
геометрическое, но и
электростатическое
соответствие
ES
Теория индуцированного (вынужденного) соответствия
Дениеля Кошланда (1959г): полное соответствие фермента
и субстрата наступает лишь в процессе их взаимодействия:
Субстрат индуцирует необходимые конформационные
изменения фермента, после чего они соеденяются.
Теория основана на данных кинетического анализа,
изучением фермент-субстратных комплексов методами
ренгено-структурного анализа, спектрографии и
кристаллографии и др.

3. Теория «индуцированного соответствия»
(современные представления)
S
A
B
A
C
B
C
E
ES
При взаимодействии фермента и субстрата оба
подвергаются модификации и подстраиваются друг под
друга. Возникающие в субстрате изменения способствуют
превращению его в продукт.

Теория переходных состояний
(промежуточных соединений)
P
S
E
ES
ES*
EP*
E
при взаимодействии фермента E с субстратом S образует
комплекс ES*, в котором реакционная способность
субстрата выше, чем в нативном состоянии. Через ряд
промежуточных соединений происходит превращение
субстрата в продукт реакции Р

Механизмы ферментативных реакции

При ферментативном катализе реализуются те
же механизмы, которые возможны без участия
ферментов:
1.
2.
3.
4.
Кислотно-основные реакции –в активном центре
фермента находятся группы -СОО- и -NН3+, которые
способны присоединять и отдавать Н.
Реакции присоединения (отщепления, замещения)
электрофильные, нуклеофильные – в активном центре
фермента находятся гетероатомы смещающие
электронную плотность.
Окислительно-восстановительные реакции – в
активном центре фермента находятся атомы,
имеющую разную электроотрицательность
Радикальные реакции.

Энергетика ферментативных реакций

Ферменты снижают энергию активации
Скорость химической реакции зависит от
концентрации реагирующих веществ
В комплексе с ферментами субстраты
превращаются в более устойчивые
промежуточные соединения, за счет чего их
концентрация резко повышается, что
способствует ускорению реакции

Неферментативная реакция
S
S*
P*
P
S
E
ES
ES*
Ферментативная реакция
EP*
E

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ БАРЬЕР РЕАКЦИИ –
кол-во энергии, которое необходимо
молекуле, чтобы вступить в химическую
реакцию.
ЭНЕРГИЯ АКТИВАЦИИ - кол-во энергии,
которое необходимо сообщить молекуле
для преодоления энергетического
барьера.

Свободная энергия системы
S*
Энергия активации
некатализируемой реакции
S
ES*
Энергия активации
катализируемой реакции
Исходное
состояние
P
Конечное состояние
Ход реакции

2Н2О + О2
2.
3.
Энергия
активации
1) 2Н2О2
Свободная энергия системы
Каталаза
1.
Ход реакции
Энергия активации:
1. В спонтанной реакции – 18 ккал/моль
2. При использовании катализатора Fe2+ – 12 ккал/моль
3. В присутствии фермента каталазы – 5 ккал/моль

Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата

Кинетика
ферментативных реакций
Зависимость скорости реакции
от концентрации субстрата
Vmax
Концентрация
фермента константа
[S]

Зависимость скорости реакции
от концентрации фермента
V
Концентрация
субстрата –
константа
концентрация
фермента

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции

Повышение температуры на 10
градусов повышает скорость
химической реакции в 2-4 раза.
При повышение температуры фермент
подвергается денатурации и теряет
свою активность.

Скорость
ферментативной
реакции
V
Количество
активного
фермента
0
10
20
Скорость
реакции активного
фермента
30
40
50
60
T

Влияние рН на скорость ферментативной реакции

Изменение концентрации Н+ меняет
химический состав фермента, его
строение и каталитическую активность.
Изменение концентрации Н+ меняет
химический состав субстрата, его
строение и способность вступать в
ферментативную реакцию.
Денатурацией фермента при очень
высоких или очень низких рН.

Зависимость скорости ферментативной реакции от рН

V
0
4
5
6
7
8
9
pH

Константа Михаэлиса-Ментона

Km – концентрация субстрата [S], при которой
скорость ферментативной реакции V равна
половине от максимальной
Vmax
Vmax
2
Km
[S]

Уравнение скорости ферментативной реакции

Vmax [S]
V = -----Km + [S]
V – скорость реакции
Vmax – максимальная скорость реакции
Km – константа Михаэлиса
[S] – концентрация субстрата

Влияние активаторов и ингибиторов на скорость ферментативных реакций

Реакции ингибирования ферментативных
процессов
ТИПЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ
I. Обратимое
II. Необратимое
Конкурентное
Неконкурентное
Бесконкуренетное
Смешанного типа
Для определения обратимости ингибирования проводят диализ
среды, где есть фермент и ингибитор.
Если после диализа восстанавливается активность фермента, то
ингибирование обратимое

Варианты взаимодействия
ингибитора с ферментом
1. Блокируют активный центр фермента
2. Меняют четвертичную структуру фермента
3. Соединяются с коферментом, активатором
4. Блокируют часть фермента, соединяющуюся с
коферментом
5. Нарушают взаимодействие фермента с
субстратом
6. Вызывают денатурацию фермента
(неспецифические ингибиторы)
7. Связываются с аллостерическим центром

Конкурентный тип ингибирования
Осуществляется веществом, близким по химическому
строению к субстрату
V
V max
V max / 2
Km
Kмi
[S]

Неконкурентный тип ингибирования
Ингибитор реагирует с ферментом иным образом, чем
субстрат, поэтому повышение концентрации субстрата не
может вытеснить ингибитор и восстановить активность
фермента
V
V max
V max
V max
V max
K
m
[S]

2. Регуляция скорости ферментативных реакций в организме

Важнейшим свойством живых организмов является способность к поддержанию гомеостаза. Гомеостаз в организме поддерживается за счет регуля

Важнейшим свойством живых организмов является
способность к поддержанию гомеостаза.
Гомеостаз в организме поддерживается за счет
регуляции скорости ферментативных реакций, которая
осуществляется за счет изменения:
I). Доступности молекул субстрата и кофермента;
II). Каталитической активности молекул фермента;
III). Количества молекул фермента.
E*
S
S
Кофермент
Витамин
Клетка
P
P

I. Доступность молекул субстрата и кофермента

Транспорт веществ через мембрану
АТФ
АДФ + Фн
антипорт
Диффузия Облегченная
Диффузия
Клетка
Первичноактивный
транспорт
Вторичноактивный
транспорт

Инсулин
Глюкоза
ГЛЮТ-4
ГЛЮТ-4
Адипоциты,
миоциты
E1, Е2, Е3…
Глюкоза
ПВК
Коферменты
Гепатоцит
Витамины
Ферменты
Коферменты

II. Регуляция каталитической активности фермента

Регуляция каталитической активности ферментов бывает:
1). Неспецифической. Каталитическая активность всех ферментов
зависит от температуры, рН и давления.
V
пепсин
V
0
50
100
t
0
аргиназа
7
14
рН
2). Специфической. Под действием специфических активаторов и
ингибиторов изменяется активность регуляторных ферментов,
которые контролируют скорость метаболических процессов в
организме.

Механизмы специфической регуляции
каталитической активности ферментов:
1). Аллостерическая регуляция;
2). Регуляция с помощью белок-белковых
взаимодействий;
3). Регуляция через ковалентную модификацию.
а). Регуляция путем
фосфорилирования/дефосфорилирования
фермента;
б). Регуляция частичным протеолизом.

1. Аллостерическая регуляция

Аллостерическими называют ферменты, активность которых
регулируется обратимым нековалентным присоединением
модулятора (активатора и ингибитора) к аллостерическому центру.
E1
S
E2
A
E3
B
E4
C
P
Активирование происходит по принципу прямой положительной
связи, а ингибирование - по принципу отрицательной обратной
связи.
Активность аллостерических ферментов изменяется очень
быстро

2. Регуляция каталитической активности ферментов с помощью белок-белковых взаимодействий

а). Активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков.
АЦ
G
G
АЦ
АТФ цАМФ
б). Регуляция каталитической активности ферментов
ассоциацией/диссоциацией протомеров
цАМФ
цАМФ
R
R
C
R
C
ПК А
цАМФ
S
C
P
R
цАМФ
S
C
P

3). Регуляция каталитической активности ферментов путем их ковалентной модификации

Регуляция активности фермента осуществляется в результате
ковалентного присоединения или отщепления от него фрагмента.
Бывает 2 видов:
а). путем фосфорилирования и дефосфорилирования ферментов; .
АТФ
АДФ
ПК
ФЕРМЕНТ
H3PO4
ФПФ
*
ФЕРМЕНТ-Ф
субстрат
продукт
H2O
б). путем частичного протеолиза ферментов (внеклеточные)
Субстрат
Трипсиноген
Продукт
Трипсин

III. Механизмы регуляции количества ферментов
Индукторы
Репрессоры
гидролиз
биосинтез
Аминокислоты
Фермент
Аминокислоты
Индукторы - это вещества которые запускают синтез ферментов
Процесс запуска синтеза ферментов называется индукцией
Ферменты, концентрация, которых зависит от добавления
индукторов, называются индуцируемыми ферментами
Ферменты, концентрация которых постоянна и не регулируется
индукторами, называются конститутивными ферментами
Базовый уровень - это концентрация индуцируемого фермента
при отсутствии индуктора.

Репрессоры (точнее корепрессоры) - вещества,
которые останавливают синтез ферментов.
Процесс остановки синтеза ферментов называется
репрессией.
Дерепрессией – называется процесс
возобновления синтеза ферментов после удаления
из среды репрессора
В качестве индукторов и репрессоров выступают
некоторые метаболиты, гормоны и биологически
активные вещества.

3. Клеточная сигнализация

В многоклеточных организмах поддержание
гомеостаза обеспечивают 3 системы:
1). Нервная
2). Гуморальная
3). Иммунная
Регуляторные системы функционируют с участием
сигнальных молекул.
Сигнальные молекулы – это органические
вещества, которые переносят информацию.
Для передачи сигнала:
А). ЦНС использует нейромедиаторы
Б). Гуморальная система использует гормоны
В). Иммунная система использует цитокины.

Гормоны - это сигнальные молекулы беспроводного системного действия
Истинные гормоны в отличии от других сигнальных молекул:
1. синтезируются в специализированных эндокринных клетках,
2. транспортируются кровью
3. действуют дистантно на ткани мишени.
Гормоны по строению делятся: на
1. белковые (гормоны гипоталамуса, гипофиза),
2. производные аминокислот (тиреоидные, катехоламины)
3. стероидные (половые, кортикоиды).
Пептидные гормоны и катехоламины растворимы в воде,
они регулируют преимущественно каталитическую
активность ферментов.
Стероидные и тиреоидные гормоны водонерастворимы,
они регулируют преимущественно количество
ферментов.

Каскадные системы
Гормоны регулируют количество и каталитическую
активность ферментов не напрямую, а
опосредовано через каскадные системы
Гормоны
Каскадные системы
Ферменты
х 1000000
Каскадные системы:
1. Многократно усиливают сигнал гормона (повышают количество или
каталитическую активность фермента) так что 1 молекула гормона
способна вызвать изменение метаболизма в клетке
2. Обеспечивают проникновение сигнала в клетку (водорастворимые
гормоны в клетку самостоятельно не проникают)

каскадные системы состоят из:
1. рецепторов;
2. регуляторных белков (G-белки, IRS, Shc, STAT и т.д.).
3. вторичных посредников (messenger - посыльный)
(Са2+, цАМФ, цГМФ, ДАГ, ИТФ);
4. ферментов (аденилатциклаза, фосфолипаза С,
фосфодиэстераза, протеинкиназы А, С, G,
фосфопротеинфосфотаза);
Виды каскадных систем:
1. аденилатциклазная,
2. гуанилатциклазная,
3. инозитолтрифосфатная,
4. RAS и т.д.),

Рецепторы

Рецепторы - это белки, встроенные в клеточную мембрану или
находящиеся внутри клетки, которые, взаимодействуя с
сигнальными молекулами, меняют активность регуляторных белков.
По локализации рецепторы делятся на:
1) цитоплазматические;
2) ядерные;
3) мембранные.
По эффекту рецепторы делятся на:
активаторные (активируют каскадные системы)
ингибиторные (блокируют каскадные системы).
По механизму передачи сигнала рецепторы делятся на 4 типа:
1). Рецепторы, связанные с ионными каналами
2). Рецепторы, с ферментативной активностью.
Бывают 3 видов:
а). Рецепторы, с тирозинкиназной активностью (тирозиновые
протеинкиназы).
б). Рецепторы, с фосфатазной активностью (тирозиновые
протеинфосфотазы) (например, ФПФ).
в). Рецепторы с гуанилатциклазной активностью (ГЦ).
3). Рецепторы, сопряженные с G-белками по строению их еще
называют серпантинными.
4). Ядерные и цитоплазматические рецепторы.

Рецептор, связанный с ионным каналом

Работа рецептора связанная с G-белком (серпантинный)

Рецептор с ферментативной активностью (тирозинкиназный)
инсулин
a
a
инсулин
инсулин
a
a
a
b
b
b
b
тир
тир
тир
тир
АТФ
АДФ
b
a
b
тир-Ф* тир-Ф*
IRS-1
IRS-1-Ф*
АТФ АДФ
ФПФ
ФПФ*

Аденилатциклазная система
Гормоны:
Глюкагон, Вазопресин, Катехоламины (через β2-адренэргические рецепторы)
Гормоны гипофиза (АКТГ, ЛДГ, ФСГ, ЛТ, МСГ, ТТГ), паратгормон, Фактор роста
нервов
PGE1
Г
R
Цитоплазматическая мембрана
G
A
Ц
цитоплазма
АТФ цАМФ
ПК А
Фермент неакт
ПК А*
АТФ
АДФ
Фермент акт
субстрат
Ф
продукт
Имеются
αи
β-адренергические
рецепторы
мембран клеток печени, мышц и жировой ткани.
в
плазматических

Гуанилатциклазная система
Сигнальные молекулы:
ПНФ (расслабление тонуса сосудов),
Катехоламины (через α-адренэргические рецепторы)
Бактериальный эндотоксин (блокирует всасывание воды вызывает диарею)
NO, продукты ПОЛ (цитоплазматическая ГЦ)
Г
ГЦ
Цитоплазматическая мембрана
цитоплазма
ГТФ цГМФ
ПК G
Фермент неакт
ПК G*
АТФ
АДФ
Фермент акт
субстрат
Ф
продукт
Гуанилатциклазная система функционирует в легких, почках, эндотелии
кишечника, сердце, надпочечниках, сетчатке и др. Она участвует в регуляции
водно-солевого обмена и тонуса сосудов, вызывает релаксацию и т.д.

Инозитолтрифосфатная система
Гормоны:
гонадолиберин, тиролиберин, дофамин, тромбоксаны А2, эндоперекиси,
лейкотриены, агниотензин II, эндотелин, паратгормон, нейропептид Y,
адренергические катехоламины (через α1 рецепторы), ацетилхолин,
брадикинин, вазопрессин (через V1 рецепторы).
Г
R
G
ФЛ С
Цитоплазматическая мембрана
ФИФ2
ДГ
2+
ИТФ Са
субстрат
Кальмодулин -4Са2+
ПК С
цитоплазма
продукт
Фермент неакт
Са2+
Кальмодулин -4Са2+
Кальмодулин
Фермент акт
субстрат
продукт

Трансмембранная передача информации с участием
цитоплазматических рецепторов
белок
Г
шаперон
Цитоплазматическая
мембрана
ЦПР
белок
Г
шаперон
Гормоны:
Кортикоиды,
половые,
тиреоидные
Г
ЯДРО
ЦПР
Г
ЦПР
ДНК
цитоплазма
субстрат
продукт
Транскрипция
мРНК
Трансляция
мРНК
Фермент
рибосома